Σκέφτηκε να γίνει ηθοποιός, αφού έβλεπε παλιές ταινίες και παρακολουθούσε μουσικό θέατρο, αλλά φοβόταν την αποτυχία σε έναν τόσο απαιτητικό χώρο. Έτσι, εμφανίστηκε μόνο σε ένα θεατρικό έργο του Γυμνασίου της.
Με την υποκριτική άρχισε να ασχολείται σοβαρά όταν φοιτούσε στο Πανεπιστήμιο της Νέας Υόρκης. Αυτή που την ενέπνευσε ήταν η μεγαλύτερη αδερφή της, η ηθοποιός Kate Mara.
Το 2005 εμφανίζεται ως Patricia Mara με την αδερφή της Kate στην ταινία τρόμου Urban Legends: Bloody Mary.
Το 2006 ξεκινάει να ασχολείται με την τηλεόραση. Εκεί κάνει το επαγγελματικό της ντεμπούτο ως Tricia Mara σε ένα επεισόδιο του δράματος Law & Order: Special Victims Unit.
Το 2007 πάλι ως Tricia Mara εμφανίζεται ως γκεστ στο δικαστικό τηλεοπτικό δράμα Women's Murder Club.
Το 2008 εμφανίζεται σε ένα επεισόδιο της δραματικής τηλεοπτικής σειράς The Cleaner και κάνει το ντεμπούτο της ως Tricia Mara στη ρομαντική ταινία μεγάλου μήκους Dream Boy.
Το 2009 κερδίζει τον πρώτο της πρωταγωνιστικό ρόλο στη δραματική ταινία ενηλικίωσης Tanner Hall στο σκηνοθετικό ντεμπούτο της Tatiana von Fürstenberg και της Francesca Gregorini. Την περίοδο εκείνη αφήνει στην άκρη το μικρό της όνομα Patricia/Tricia και καθιερώνει το Rooney. Την ίδια χρονιά εμφανίζεται, επίσης, στις ταινίες Youth in Revolt, Dare, Friends (with Benefits) και The Winning Season.
Το 2010 πρωταγωνιστεί στο ριμέικ της ταινίας τρόμου του 1984 A Nightmare on Elm Street. Υποδύεται τη Nancy Holbrook, μια μαθήτρια Γυμνασίου που πέφτει θύμα του Freddy Krueger. Την ίδια χρονιά υποδύεται την Erica Albright, την πρώην κοπέλα του Mark Zuckerberg, στη βιογραφική δραματική ταινία The Social Network του David Fincher.
Το 2011 έχει τον πρωταγωνιστικό ρόλο στην κινηματογραφική μεταφορά του The Girl with the Dragon Tattoo, της πρώτης τριλογίας βιβλίων Millennium του Stieg Larsson. Στην ταινία αυτή, του David Fincher, υποδύεται τη Lisbeth Salander, μια λαμπρή αλλά προβληματική χάκερ υπολογιστών που βοηθά τον δημοσιογράφο Mikael Blomkvist (Daniel Craig) να λύσει μια σειρά από φόνους. Η Rooney Mara κερδίζει την παγκόσμια αναγνώριση από τους κριτικούς και προτείνεται το 2012 για το Βραβείο Χρυσής Σφαίρας Καλύτερης Γυναικείας Ερμηνείας σε κινηματογραφική ταινία - Δράμα. Για την ίδια ταινία κερδίζει το 2012 την πρώτη της υποψηφιότητα για το Όσκαρ Α' Γυναικείου Ρόλου.
To 2013 πρωταγωνιστεί στην αστυνομική δραματική ταινία Ain't Them Bodies Saints, στη δραματική ταινία Her του Spike Jonze, έχοντας τον ρόλο της πρώην συζύγου του κεντρικού χαρακτήρα Theodore Twombley (Joaquin Phoenix), στο ψυχολογικό θρίλερ Side Effects του Steven Soderbergh, έχοντας τον ρόλο της Emily Taylor, μιας γυναίκας που στρέφεται στα συνταγογραφούμενα φάρμακα ως τρόπο να χειριστεί το άγχος της σχετικά με την επικείμενη αποφυλάκιση του συζύγου της.
Τον Μάιο του 2013 γίνεται το νέο πρόσωπο του νέου αρώματος Downtown του Calvin Klein.
To 2014 πρωταγωνιστεί στο δραματικό θρίλερ Trash σε σκηνοθεσία του Stephen Daldry.
Το 2015 έχει τον ρόλο της Tiger Lily στην ταινία φαντασίας Pan σε σκηνοθεσία του Joe Wright και τον ρόλο της Therese Belivet στη ρομαντική ταινία Carol σε σκηνοθεσία του Todd Haynes. Για τη δεύτερη αυτή ταινία η Rooney Mara προτείνεται το 2016 για το Βραβείο Χρυσής Σφαίρας Καλύτερης Γυναικείας Ερμηνείας σε κινηματογραφική ταινία - Δράμα αλλά και για το Όσκαρ Β' Γυναικείου Ρόλου.
To 2016 πρωταγωνιστεί στη δραματική ταινία Una στο πλευρό του Ben Mendelsohn σε σκηνοθεσία του Benedict Andrews, στη ρομαντική ταινία The Secret Scripture μαζί με τον Theo James και τον Eric Bana σε σκηνοθεσία του Jim Sheridan και στο σπουδαίο βιογραφικό δράμα Lion μαζί με τους Dev Patel και Nicole Kidman σε σκηνοθεσία του Garth Davis. Η ταινία αυτή έτυχε καλής αποδοχής από τους κριτικούς με επαίνους για την υποκριτική, το συναίσθημα, τα γραφικά και την κινηματογράφηση. Έλαβε το 2017 έξι υποψηφιότητες για Όσκαρ συμπεριλαμβανομένων της Καλύτερης Ταινίας και του Καλύτερου Διασκευασμένου Σεναρίου.
Το 2017 πρωταγωνιστεί με τον Robert Redford στη δραματική ταινία επιστημονικής φαντασίας The Discovery σε σκηνοθεσία του Charlie McDowell, με τον Casey Affleck στη δραματική ταινία φαντασίας A Ghost Story σε σκηνοθεσία David Lowery και με τους Ryan Gosling, Natalie Portman και Cate Blanchett στη μουσική ρομαντική ταινία Song to Song του Terrence Malick.
Το 2018 πρωταγωνιστεί με τους Joaquin Phoenix, Jonah Hill και Jack Black στη βιογραφική δραματική ταινία Don't Worry He Won't Get Far on Foot σε σκηνοθεσία του Gus Van Sant και με τον Joaquin Phoenix στη θρησκευτική βιογραφική δραματική ταινία Mary Magdalene σε σκηνοθεσία του Garth Davis. Στη δεύτερη αυτή ταινία τόσο η ερμηνεία της όσο και το εκφραστικό πρόσωπό της συγκλονίζουν.
Το 2021 συμπρωταγωνιστεί με τους Bradley Cooper, Cate Blanchett και Toni Collette στο νεο-νουάρ ψυχολογικό θρίλερ Nightmare Alley, μια προσαρμογή του ομώνυμου μυθιστορήματος του 1946 σε σκηνοθεσία Guillermo del Toro. Η ταινία αποσπά την αποδοχή των κριτικών, συμπεριλαμβάνεται στις 10 καλύτερες ταινίες της χρονιάς από τα Βραβεία του Αμερικανικού Ινστιτούτου Κινηματογράφου και έχει το 2022 τέσσερις υποψηφιότητες στα Βραβεία Όσκαρ συμπεριλαμβανομένου και αυτού της Καλύτερης Ταινίας.
Η Rooney Mara πέρα από τις επιτυχίες της στον κινηματογράφο έχει έντονη φιλανθρωπική δράση. Είναι ιδρυτής της φιλανθρωπικής οργάνωσης Faces of Kibera, η οποία έχει ως στόχο να παρέχει στέγαση, τροφή και ιατρική περίθαλψη σε ορφανά στην Kibera, μια παραγκούπολη του Ναϊρόμπι της Κένυας. Το 2006 επισκέπτεται ως εθελόντρια την περιοχή και κάνει όλες τις απαραίτητες κινήσεις για να βοηθήσει τα ορφανά, πολλά από τα οποία έχουν χάσει γονείς από AIDS και ασθένειες που σχετίζονται με τον HIV. Η ίδρυση της φιλανθρωπικής της οργάνωσης σχετίζεται και με την απογοήτευσή της από τον αυξανόμενο αριθμό μη κερδοσκοπικών οργανισμών που είναι απλώς επιχειρηματικές ευκαιρίες. Τον Ιανουάριο του 2011 η Faces of Kibera συγχωνεύεται με το Ίδρυμα Uweza, το οποίο εκτελεί προγράμματα ενδυνάμωσης με βάση την κοινότητα στην Kibera και η Rooney Mara είναι πρόεδρος του Διοικητικού Συμβουλίου του Ιδρύματος.
Από τα τέλη του 2016 διατηρεί σχέση με τον Αμερικανό ηθοποιό Joaquin Phoenix, τον συμπρωταγωνιστή της στις ταινίες Her, Don't Worry He Won't Get Far on Foot και Mary Magdalene. Αρραβωνιάζονται τον Ιούλιο του 2019 και τον Σεπτέμβριο του 2020 αποκτούν τον γιο τους, που ονομάζεται River από τον αείμνηστο αδελφό του Joaquin Phoenix, River Phoenix.
